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為什么是綠色熒光蛋白？
GFP是一種約27kda的蛋白質(zhì)，由238個(gè)氨基酸組成，來源于水晶水母aequoreavictoria。它在可見光譜的綠色部分具有熒光發(fā)射波長（因此得名），這是由于蛋白質(zhì)中心的三種特定氨基酸（Ser65、Tyr66和Gly67）的成熟反應(yīng)形成的生色團(tuán)。當(dāng)?shù)谝淮伪话l(fā)現(xiàn)時(shí)，GFP最令人驚訝的一個(gè)方面是發(fā)色團(tuán)是自發(fā)形成的，沒有額外的輔助因子、底物或酶活性，它只需要在成熟過程中有氧存在。這意味著蛋白質(zhì)可以直接從A到B，并在任何生物體中表達(dá)，同時(shí)仍保持熒光。
1996年首次報(bào)道的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是11β-包含“Barrel”形的薄片，發(fā)色團(tuán)隱藏在結(jié)構(gòu)的中心，不被水溶劑淬火。這種緊密排列的結(jié)構(gòu)解釋了整個(gè)GFP蛋白的重要性，它幾乎完全是維持熒光活性所必需的；與當(dāng)時(shí)的傳統(tǒng)熒光染料相比，GFP的主要優(yōu)勢(shì)在于它無毒，并且可以在活細(xì)胞中表達(dá)，從而可以研究動(dòng)態(tài)的生理過程。
重新設(shè)計(jì)GFP以增加其顏色和應(yīng)用范圍
幾乎在它的序列被闡明之后，科學(xué)家們就開始通過突變來改造GFP的新版本，以改善其物理和生化特性。1995年，羅杰Y。Tsien描述了一個(gè)S65T點(diǎn)突變，它增加了GFP的熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性。這也將其主要激發(fā)光從395nm移到了488nm，有效地改善了野生型蛋白的缺陷，促進(jìn)了其在研究中的廣泛應(yīng)用。許多其他的突變已經(jīng)被引入到GFP中，新的熒光團(tuán)不斷被設(shè)計(jì)。下表1列出了幾種常見的熒光蛋白及其相對(duì)于野生型GFP的突變。雖然這里沒有列出，但每種顏色中的許多滲透也存在，它們之間只有細(xì)微的差別。
請(qǐng)注意，在光譜的紅色部分發(fā)現(xiàn)的許多熒光蛋白不是GFP衍生物，而是與從Discosoma sp.分離的dsRed蛋白有關(guān)。已經(jīng)做了類似的工作來擴(kuò)展紅色熒光蛋白庫；然而，這些蛋白質(zhì)是獨(dú)特的綠色熒光蛋白和突變定義中發(fā)現(xiàn)的表2可能不適用。
表1：包含普通熒光團(tuán)的特異性突變
表二：GFP衍生物特異性突變的功能作用
多種應(yīng)用
由于GFP及其易用性，GFP等熒光蛋白已成為分子生物學(xué)的主流?？茖W(xué)家可以很容易地利用含有GFP的質(zhì)粒作為一種手段，達(dá)到許多功能目的，以下是一些常用的用途，但是目前還有許多其他的用途，并且新的GFP技術(shù)正在不斷發(fā)展！
融合標(biāo)記：GFP是最常見的用途之一，它可以與蛋白質(zhì)的N-或C-末端融合，這使科學(xué)家能夠可視化基因表達(dá)的時(shí)間和地點(diǎn)。
轉(zhuǎn)錄報(bào)告員：將GFP置于感興趣的啟動(dòng)子的控制下，可以用來有效地監(jiān)測(cè)特定細(xì)胞類型中啟動(dòng)子的基因表達(dá)。這種轉(zhuǎn)錄報(bào)告是GFP最早的應(yīng)用之一。
F?rster共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）：這是用來研究兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用，或在兩個(gè)蛋白質(zhì)域之間發(fā)生構(gòu)象變化的相互作用。典型地，使用了兩種具有重疊激發(fā)/發(fā)射光譜的熒光蛋白；融合到每個(gè)正在測(cè)試的蛋白質(zhì)或域的一個(gè)。在這里找到微動(dòng)質(zhì)粒。
分裂EGFP：作為一種替代fet的方法，拆分EGFP也被用來研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。在這種情況下，EGFP的兩部分融合到感興趣的蛋白質(zhì)中，當(dāng)它們接近時(shí)，EGFP的兩部分經(jīng)歷折疊、成熟和熒光。
生物傳感器：采用FRET、鈣調(diào)蛋白等多種策略，設(shè)計(jì)了一系列基于GFP的熒光生物傳感器，用于檢測(cè)各種細(xì)胞內(nèi)條件，包括離子（如Ca2+）濃度和pH等。
光遺傳學(xué)：科學(xué)家可以利用光來檢測(cè)、測(cè)量和控制分子信號(hào)、細(xì)胞和細(xì)胞群，以了解它們的活動(dòng)，并可視化改變對(duì)這種活動(dòng)的影響。了解更多關(guān)于光遺傳學(xué)的開放式光遺傳學(xué)，并在Addgene找到光致執(zhí)行器和傳感器。
細(xì)胞標(biāo)記/選擇：表達(dá)結(jié)構(gòu)如質(zhì)粒通常包括GFP作為標(biāo)記，以幫助識(shí)別哪些細(xì)胞成功地獲得了質(zhì)粒。這可以作為選擇抗生素的替代品。這種類型的質(zhì)?？赡茉诟信d趣基因的附加啟動(dòng)子的控制下，或與感興趣基因相同的轉(zhuǎn)錄子表達(dá)GFP，但在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）之后。這通常用于FACS的連接（見下文）。
熒光活化細(xì)胞分選（FACS）：這是一種流式細(xì)胞術(shù)，它根據(jù)熒光信號(hào)將細(xì)胞混合物分離成不同的群體。因此，FACS可以用于將表達(dá)GFP的細(xì)胞與非GFP的細(xì)胞分離。
發(fā)育/轉(zhuǎn)基因用途：GFP由于其穩(wěn)定性，可用于細(xì)胞命運(yùn)研究中的遺傳跟蹤能力。當(dāng)利益促進(jìn)者控制時(shí)，它也可以用來形象地顯示這些促進(jìn)者活躍的發(fā)展階段。此外，GFP還可以標(biāo)記經(jīng)轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞，然后可用于轉(zhuǎn)基因小鼠的植入和生成。
純化：GFP可作為蛋白質(zhì)純化的一般表位標(biāo)記，并可獲得大量的GFP商業(yè)抗體。
其他：我們只是在為GFP的潛在應(yīng)用程序的表面劃傷了一下。它還被用于在藥物篩選中識(shí)別特定細(xì)胞群，在癌癥研究中可視化裸鼠的微轉(zhuǎn)移，充當(dāng)DNA雙鏈斷裂修復(fù)的報(bào)告員，并標(biāo)記致病性細(xì)胞內(nèi)微生物，以可視化宿主/病原體相互作用。